Nach ihrem Schulabschluss an der "Baldwin High School" gibt Margaret Colin ihr Schauspiel-Debüt in der Serie "The Edge of Night". Zwei Jahre lange ist sie dort als "Paige Madison" auf der Mattscheibe zu bewundern. Ein Jahr später wird die Schauspielerin Cast-Mitglied in der Sendung "As the World Turns", wo sie bis 1983 mitwirkt. 1986 spielt sie erstmals in dem Spielfilm "Pretty in Pink" mit, bevor sie in der Kriminal-Komödie "Gefährliche Freundin" an der Seite von Jeff Daniels und Melanie Griffith mitwirkt.
Ihre erste große Rolle in einem Kinofilm hat Margaret Colin in dem Science-Fiction-Streifen "Independence Day", wo unter anderem Will Smith eine der Hauptrollen übernommen hat. Vier Jahre später wird die Schauspielerin mit dem "Saturn Award" ausgezeichnet, für ihre Leistung in der TV-Serie "Now and Again". Zudem kann sich Colin eine Rolle in dem Beziehungsdrama "Untreu" mit Richard Gere und Diane Lane in den Hauptrollen auf den Steckbrief schreiben.
Eine weitere große Rolle, die Margaret Colin an Land zieht, ist in der Teenieserie "Gossip Girl". Fünf Jahre lang mimt sie dort "Eleanor Waldorf", die Mutter von "Blair Waldorf". Nachdem für die Sendung die letzte Klappe gefallen ist, steht die Schauspielerin in den Filmen "You Must Be Joking" und "Kelly & Cal" vor der Kamera.